Nacida infanta de España y archiduquesa de Austria, Juana (24 de junio de 1535-7 de septiembre de 1573)  fue por matrimonio princesa de Portugal. Fue, además, regente del reino en ausencia del emperador y de su heredero, Felipe II. Ella era quien gobernaba en España a la muerte de la reina Juana I, su abuela, en 1554.

En esa trenza de matrimonios e intereses que ligó a los sucesores de los Reyes Católicos, esta Juana, de las muchas con el mismo nombre que abundaron en las casas de Trastamara y de Austria, fue la cuarta de los seis hijos habidos en el matrimonio de Carlos I de España y V de Alemania con Isabel de Portugal. 

Tenía siete años cuando fue prometida al príncipe heredero de Portugal, en otro de los enlaces dobles tan frecuentes entre ambos reinos. Obsérvese que Carlos I e Isabel, nietos ambos de los Reyes Católicos, negociaban el matrimonio de sus hijos con los hijos de la pareja formada por Juan III de Portugal y Catalina de Aragón, ésta hija póstuma de Felipe el Hermoso y de Juana I de Castilla, nietos, por tanto, de los mismos reyes Isabel y Fernando.

Juana fue comprometida con Juan Manuel y Felipe, el primogénito del emperador, con María Manuela. El doble compromiso se firmó en 1542 y el matrimonio del heredero de la corona española se celebró al año siguiente; el de la infanta y el heredero portugués tuvo que esperar hasta 1552 cuando la pareja contaba 17 y 14 años, respectivamente. Ambos resultaron enlaces frustrados pues la novia portuguesa murió en 1545, después de haber dado un heredero a la corona, el malogrado príncipe Carlos, y su hermano murió en 1554, dejando embarazada a Juana de quien habría de reinar como Sebastián I. La princesa de Portugal daba a luz a este niño el 20 de enero de 1554 y dos meses después era reclamada por su hermano, Felipe II, para que se hiciera cargo de la gobernación del reino, en ausencia del emperador, que gobernaba saltándose toda legalidad pues aún vivía su madre, la reina Juana, aunque recluida en Tordesillas. Felipe, tras nueve años viudo, había decidido casarse con la reina de Inglaterra, María Tudor; matrimonio que unía a un biznieto con una nieta de los Reyes Católicos pues ella era hija de Enrique VIII y Catalina de Aragón. Verdaderamente, para relacionarse con esta familia era necesario llevar un mapa genealógico.

La pobre Juana, recién parida, quiso llevar consigo al heredero de la corona portuguesa pero la reina Catalina, su suegra-tía, decidió que era demasiado arriesgado para el niño y para la corona así que se hizo cargo de ambos, del trono y del nieto, porque el rey Juan III moriría en 1557 sin que Juana hubiera vuelto a Portugal.

Mujer muy piadosa, como no podía ser menos en una hija de Carlos y de Isabel, en 1557 Juana fundó el convento de las Descalzas Reales de Madrid, levantado sobre el solar donde estaba la casa en la que la infanta había nacido, convento que entregó a las monjas clarisas de Gandía enviadas por Francisco de Borja, cuya tía fue la primera abadesa, aunque murió antes de llegar a Madrid. Cuando su hermano Felipe volvió a España en 1559 (viudo de nuevo y dispuesto a casarse con Isabel de Valois), Juana vivió a caballo entre el convento y la corte. Mujer de gran belleza -cualidad que a la sazón era más valorada que su indudable talento- su hermano trató que casarla con el duque de Orleans, que luego reinaría en Francia como Enrique III, y aún con el príncipe Carlos, propuestas que no llegaron a cuajar.

Hay algo más que hace singular a esta Juana de Austria: es la única mujer miembro de una orden religiosa que no admite mujeres en su seno, la Compañía de Jesús. Fue Francisco de Borja quien propuso y consiguió su admisión en 1554. Este noble, que de niño había sido paje de la infanta Catalina en el palacio de Tordesillas y de joven, caballerizo de la emperatriz Isabel, después de enviudar ingresó en la orden fundada por Ignacio de Loyola, radicalmente opuesto a la admisión de mujeres. Para no contravenir los estatutos jesuitas la infanta fue admitida bajo el seudónimo de Mateo Sánchez, hizo votos de pobreza, castidad y obediencia, pero no de carácter perpetuo.

Después de una vida intensa, murió en El Escorial  y fue enterrada en el convento de las Descalzas donde sus restos descansan bajo la magnífica estatua orante esculpida por Pompeio Leoni.